3 de Julio - 8va semana de pasantía

Una vez que ya hicimos la electroforesis con gel de agarosa la semana pasada, esta vez estaba listo para poner las muestras con las enzimas de restricción. Debido a que necesita toda una noche de incubación a 37 grados, Javier, las mezclo con las enzimas de restricción la semana pasada y las dejo en la heladera hasta hoy en día que las usaríamos. Para poder ver si hay algún polimorfismo en los genes de las muestras, tuvimos que hacer un gel de poliacrilamida. Hicimos un gel 10% (que es mas duro y mas finito que el gel de agarosa, ademas tiene poros mas pequeños para que sea mas especifico y se pueda diferenciar bien las diferentes bandas). El gel contenía stock 29:1 al 30%, Tae 50x, agua destilada, APS 10% y Temed. A las muestras con las enzimas les pusimos el buffer. También nos había sobrado un poco de la muestra 3 y la 4 sin enzimas, lo cual lo usamos también para ver si las enzimas cortan y poder comparar que ninguna banda quede en el mismo nivel, a este también le agregamos el buffer. Debido a que era una cuba que se utilizaba para hacer western, no le pusimos el bromuro de tidio al principio para no contaminar la cuba, pero una vez que corrió, sumergimos el gel en buffer y bromuro, para luego poder verlo con la luz ultravioleta. De mientras que esperábamos, ya que esto tardaba bastante en correr, ayudamos un poco en el laboratorio a hacer soluciones, como por ejemplo hicimos un Gel Buffer con PH 8,8 y otra solución fue Stackin Gel Buffer PH 6,8.



Terminamos de hacer las soluciones y el gel ya estaba listo para poder llevarlo a la luz ultravioleta, cuando lo llevamos le sacamos un foto y es la siguiente:


Por algun error, las bandas en el gel salieron corridas como se puede ver en la foto, pero igualmente se pueden diferenciar las diferentes bandas.

nos vemos la proxima! chaoo!

26 de junio - 7mo día de pasantía

Una vez más en el laboratorio, continuamos lo que habiamos hecho la semana pasada. Realizamos una electroforesis en gel de agarosa 1.5%. El objetivo de la misma era comprobar si la PCR de la semana pasada habia salido bien.


Miestras dejabamos correr las muestras Paola, otra investigadora que trabaja en el laboratorio, nos conto un poco acerca de lo que hacia, que investigaba y nos explico sobre las lineas celulares, que tipo de crecimiento tienen, lo cual pudimos ver en el microscopio invertido ( la lente se situa por debajo de donde se apoya la muestra a examinar) .


Luego de que la corrida habia terminado, procedimos a ver con luz UV las bandas que se formaron y pudimos deducir que como dos de muestras tenian bandas más débiles debiamos usar de los mismo un poco mas de cada uno. Ahora pasamos a preparar las muestras para que sean tratadas con enzimas de restricción. Calculamos las cantidades de cada reactivo ( de producto de PCR, de H2O, de Buffer 10x y de encimas ECO 130I ). En esta parte tuvimos que hacer una pequeña modificación por el detalle que les contamos antes, con lo cual al momento de calcular la cantidad de producto de PCR que habia que utilizar para la digestión con ennzimas, tuvimos que agregar 5 ml más esas, con lo cual el volumen de agua a agregar para llevar a volumen final era distinto. A causa de esto, al momento de preparar la Master Mix tomamos el volumen menor de agua, y luego agregariamos la diferencia.


Como la incubación es overnight, lo que significa que se deja toda la noche con las enzimas, Javier dejó las muestras a 37 ºC para que se realice la digestión y luego se congelarian para que la semana que viene pudiesemos seguir trabajando con las mismas.