En la tercera semana realizamos una electroforesis con las muestras de ADN extraídas la semana pasada. Para ello preparamos el gel de agarosa 1%, y acondicionamos las muestras y la cuba (tuvimos la precaución de verificar que las calles donde van las muestras estén del polo negativo, ya que como el ADN tiene carga negativa, corre hacia el polo positivo). Previamente a la siembra de las muestras originales, practicamos como sembrar con buffer de siembra (compuesto por glicerina 30%, colorante azul y H2Od) para así adquirir mejor manejo de la pipeta a la hora de sembrar. Luego lo hicimos con los ADN de los distintos pacientes y a lo ultimo sembramos el marcador de peso molecular (PM 50 pb- Marker). Igualmente, como eran las primeras veces tuvimos algunos inconvenientes durante la sembrada, lo cual iremos corrigiendo y perfeccionando con el tiempo.
Ya todo preparado, conectamos la cuba y la dejamos correr a 100 ev. (Verificamos la salida de burbujas, lo que significa que pasa corriente)
Mientras que la electroforesis estaba en proceso, Javier nos dio una introducción de lo que íbamos a hacer la semana entrante. Empezamos hablando sobre la teoría de la PCR, nos explico la diferencia entre hacer un primer por computadora, usando distintas paginas, a hacerlo manualmente, donde hay que tener en cuenta distintos cuidados en la practica a la hora de diseñarlo, como por ejemplo:
1) Los primer deben estar formados en lo pasible por un 50% de bases A y T y otro 50% de C y G.
2) Para que el segundo paso de la PCR, el annealing, sea satisfactorio el primer reverse y el forward deben tener una TM (Tº optima) similar. (Ya que si difieren mucho y hay q establecer una Tº media, puede que uno de los dos no se pegue ya que la temperatura es muy alta, y el otro se pegue en algún lugar indebido, ya que la temperatura para el es muy baja.)
3) Hay que tener la precaución de que el primer forward y el reverse no se peguen entre si.
Luego de charlar un tiempo mas, finalmente bajamos a las computadoras de la universidad (vale mencionar que el investigador nos dio una cuenta para que las podamos usar cuando querramos) y navegamos por Internet donde Javier nos mostró algunas paginas y los pasos a seguir para diseñar y encontrar un primer en Internet.
Al volver al laboratorio, ya casi se hacia la hora, nos menciono que en la próxima semana haríamos una PCR, para lo cual nos planteo un problema sobre concentraciones.
Debíamos calcular, sabiendo el volumen final y las concentraciones final e iniciales, cuanto volumen de cada compuesto debíamos usar (usamos datos de una PCR), así de a poco, con la practica, nos vamos a ir familiarizando con la técnica.
Hasta la próxima.
