16 de octubre de 2008 - 21va semana de pasantía

Luego de una semana sin venir al laboratorio, y al saber que solo nos quedaban dos semanas de pasantia , tuvimos que planear una manera de alcanzar a realizar todos los analisis de las muestras para poder tener todos los resultados y hacer estadisticas en base a los mismos.
Por lo tanto hoy fué nuestra última PCR sobre el polimorfismo CDA.

Mientra las muestras estaban en la cicladora, hicimos una electroforesis en gel de agarosa para las muestras de la semana pasada sobre el polimorfismo MDR1.
Al terminar de correr las muestras e ir al lab para revelar los resultados en luz ultravioleta, pudimos ver que habiamos cometido un error al preparar la electroforesis, ya que queriamos correr las muestras de MDR1, pero sin darnos cuenta sembramos el Marker de CDA, es por esto que las bandas de las muestras no quedaron a la misma altura que la banda del Marker. Sin embargo, en base a su experiencia, Javier se dió cuenta de lo ocurrido y encontró la manera de compararlo con el Marker correspondiente de MDR1.


Esperamos verlos mas seguido!

9 de Octubre de 2008 - 20va semana de pasantia

Feriado por Iom Kipur (Dia del perdón).

2 de Octubre de 2008 - 19va semana de pasantía

Lo primero que hicimos esta semana fue una PCR del polimorfismo MDR. Usamos las mismas muestras de ADN de la semana pasada. Esta vez hicimos de 30 ml por tubo, aunque previamente hicimos un MIX como siempre.

En la master mix pusimos:
54,0 microlitros de Buffer
43,2 microlitros de Mg++
108,0 microlitros de dnTPs
16,2 microlitros de Primer mix
5,4 microlitros de Taq Pol
295,2 microlitros de H2O

Luego pusimos 29 micrlitros en cada eppendorf y previamente rotulados todos los eppendorfs con los numeros de muestra le agregamos 1,0 micrlitro de ADN de cada muestra.Una vez que llevamos todos los tubos a la cicladora hicimos un gel de agarosa para hacer una electroforesis de las muestras de la semana pasada con el polimorfismo GSTP.

Una vez que termino de correr el gel, lo llevamos a ver con luz ultravioleta y le sacamos una foto para analizar los resultados obtenidos.


Nos vemos la semana siguiente!!!

25 de septiembre de 2008 - 18va semana de pasantía

Hoy realizamos una PCR del polimorfismo GSTP para las mismas 16 muestras que comenzamos a analizar la semana pasada y las cuales estudiaremos más en profundidad.
Para esto realizamos una master MIX contando las 16 muestras, más el agua y una extra por si hacia falta.
Hicimos los calculos a mano como siempre, y ahora que ya sabemos como hacer las cuentas, Javier nos mostó como lo programo en Excel para unicamente ingresar algunos datos y automaticamente obtenemos los microlitros que debemos tomar de cada sustancia, así se agiliza la técnica.
Mientras esperabamos que termine la cicladora, realizamos una electroforesis de los productos de la PCR de la semana pasada sobre el polimorfismo en el gen GSTT y GSTM.

Luego de que conectamos la cuba y la dejamos corriendo a 100 V utilizamos el tiempo "muerto" para conversar con nuestro investigador sobre las experiencias vividas en nuestro viaje de egresados y le dimos un regalo que trajimos desde San Carlos de Bariloche para él y todo el equipo del laboratorio como muestra del agradecimiento por la buena onda y voluntad para que nosotras aprendamos.

Esperamos verlos la semana que viene!

18 de Septiembre de 2008 - 17va semana de pasantia

Hoy fue la primera semana que vinimos a ciudad universitaria luego de nuestro viaje a Bariloche, ya que las anteriores dos semanas no pudimos asistir por distintas causas.Conversamos con nuestro investigador, y nos conto que a partir de ese dia en adelante ibamos a trabajar con las mismas 16 muestras de ADN de pacientes para poder analizarlas y poder sacar a partir de los resultados, conclusiones sobre la relacion entre los polimorfismos MDR, GSTT, GSTM, GSTP y CDA y la evolucion de los pacientes luego de haber finalizado sus respectivos tratamientos.Es por esto que hoy mismo comenzamos con la primer PCR con estas muestras, de los polimorfismos GSTT y GSTM.Para obtener un volumen final de 15 microlitros, y teniendo en cuenta las cantidades para 18 tubos ( 16 muestras , mas un negativo y se calcula uno mas por si hay error), realizamos una Master Mix con:
PCR Buffer 27 ul
Mg ++ 27 ul
dNTPs 81 ul
Primer Mix 8.1 ul
DMSO 13.5 ul
Taq Pol 4.32 ul
H2O 91.08 ul
DNA 1ul ( muestra por tubo ) ó 1 ul de H2O en el caso del negativo

Lo llevamos a la cicladora y al finalizar Javier congeló las muestras para poder hacer la electroforesis la semana entrante.

Una vez que dejamos las muestras en la cicladora, Javier aprovechó para comentarnos acerca de sus avances en la investigacion durante nuestra ausencia y ya que era su cumpleaños, desayunamos con facturas que trajo para festejar.

Le habiamos traido chocolates de Bariloche, pero como nos olvidamos de llevarlos, se los daremos la proxima vez.

Exitos!

11 de septiembre de 2008 - 16va semana de pasantía

Hoy, 11 de septiembre, no concurrimos a ciudad a causa del festejo del día del estudiante, y la primavera.

La semana que viene estaremos volviendo a la pasantia regularmente.

4 de semptiembre de 2008 - 15 va semana de pasantía

Ésta sería la primera semana de pasantía luego del viaje, pero como ambas pasantes, Ayelén y Solange, estabamos enfermas, no pudimos concurrir al laboratorio.

Esperamos recuperar lo que no pudimos hacer más adelante.

Nos vemos la proxima!

14 de agosto de 2008 - 14 va semana de pasantía

Esta es la última semana antes de la entrega de la introducción, con lo cual realizamos una lentura completa de la misma, para ajustas pequeños detalles, adjuntar imágenes, información y terminar definitivamente con los arreglos.
Con el tiempo de sobra, planificamos lo que serían las últimas semanas y pensamos como terminar para llegar al final del año con la idea del proyecto bien clara y cerrada.

Ya a partir de la semana que viene no vamos a estar yendo a Ciudad Universitaria, como consecuencia del viaje de egresamos que estaremos realizando desde el 18 de Agosto hasta los primeros días de septiembre.
Nos vemos a la vuelta!

7 de Agosto de 2008 - 13 va semana de pasantía

Continuamos con la corrección de lo que habiamos escrito hasta el momento de la introduccion y añadimos algunos detalles más que el investigador consideró importantes para la misma.


Saludos

Introducción al Proyecto Final Química 2008

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24 de Julio del 2008 - 11va semana de pasantia

Esta semana realizamos un gel de poliacrilamida compuesto por:

Stock 29:1 al 30% --->6.67 ml
TAE 50X ---> 400 μ
TEMED ---> 40 μ
APS 10% ---> 200 μ

Íbamos a sembrar 16 muestras de ADN y 1 muestra sin digerir por enzimas, pero tuvimos un inconveniente en cuanto a cantidad de SC preparada para hacer dos geles, ya que hubo un incidente en el cual se desperdicio ml de SC y tuvimos que realizar un único gel en el cual sembramos 8 muestras, mas la muestra sin digerir junto con el marker .
Cuando gelificó la solución notamos de que uno de los wells tenia una burbuja con lo cual sin desaprovecharla sembramos en ella la muestra sin digerir que suipuestamente debía dar una sola banda, con el unico defecto que iba a salir carrida como se ve en la foto:




Casi llegando al final, hablamos sobre la introducción y los posibles contenidos de la misma.

17 de julio de 2008 – 10ma semana de pasantía

Una vez más en el laboratorio…
Este jueves realizamos una extracción de ADN en sangre con CTAB (bromuro de cetil-trimetil amonio). Es el segundo método de extracción que realizamos del cual hablamos uno de los primeros días.
Este método manual, a diferencia del primero que utilizamos con el Kit, requiere un mayor trato y tiempo.
A continuación el protocolo:

Al mismo tiempo que realizábamos la extracción, trabajábamos con otras muestras:
Realizamos un gel de agarosa con 4 muestras que habían sido previamente extraídas (a partir del paso 11)
Trabajamos con otras 4 muestras a partir del paso nº 7, agregándole etanol 70% para lavarlas, sacarles todas las sales que posiblemente hayan quedado etc.…

10 de julio de 2008 - 9na semana de pasantía

En esta novena semana de pasantía realizamos un gel de agarosa 1,5% en la cuba chica (de 50 ml).
Mientras corrían las muestras visualizamos un Power Point sobre fármaco genética y Javier nos introdujo un poco mas profundo acerca de temas relacionados a la investigación para que podamos ir preparándonos y mas tarde realizar la escritura de la introducción.
Trabajamos con el grafico de droga en plasma-horas, y aprendimos algunos conceptos nuevo necesarios, como por ejemplo el de MTC (mínima concentración tóxica) o MEC (mínima concentración efectiva), ambos se relacionan con la cantidad de droga en plasma con el correr de las horas y se estudia el efecto que produce en cada uno de los pacientes. A partir de esta curva se puede analizar algunas modificaciones como por ejemplo en relaciona la dosis suministrada (si algún paciente no llega a MEC puede ser que la cantidad de droga sea poca).

3 de Julio - 8va semana de pasantía

Una vez que ya hicimos la electroforesis con gel de agarosa la semana pasada, esta vez estaba listo para poner las muestras con las enzimas de restricción. Debido a que necesita toda una noche de incubación a 37 grados, Javier, las mezclo con las enzimas de restricción la semana pasada y las dejo en la heladera hasta hoy en día que las usaríamos. Para poder ver si hay algún polimorfismo en los genes de las muestras, tuvimos que hacer un gel de poliacrilamida. Hicimos un gel 10% (que es mas duro y mas finito que el gel de agarosa, ademas tiene poros mas pequeños para que sea mas especifico y se pueda diferenciar bien las diferentes bandas). El gel contenía stock 29:1 al 30%, Tae 50x, agua destilada, APS 10% y Temed. A las muestras con las enzimas les pusimos el buffer. También nos había sobrado un poco de la muestra 3 y la 4 sin enzimas, lo cual lo usamos también para ver si las enzimas cortan y poder comparar que ninguna banda quede en el mismo nivel, a este también le agregamos el buffer. Debido a que era una cuba que se utilizaba para hacer western, no le pusimos el bromuro de tidio al principio para no contaminar la cuba, pero una vez que corrió, sumergimos el gel en buffer y bromuro, para luego poder verlo con la luz ultravioleta. De mientras que esperábamos, ya que esto tardaba bastante en correr, ayudamos un poco en el laboratorio a hacer soluciones, como por ejemplo hicimos un Gel Buffer con PH 8,8 y otra solución fue Stackin Gel Buffer PH 6,8.



Terminamos de hacer las soluciones y el gel ya estaba listo para poder llevarlo a la luz ultravioleta, cuando lo llevamos le sacamos un foto y es la siguiente:


Por algun error, las bandas en el gel salieron corridas como se puede ver en la foto, pero igualmente se pueden diferenciar las diferentes bandas.

nos vemos la proxima! chaoo!

26 de junio - 7mo día de pasantía

Una vez más en el laboratorio, continuamos lo que habiamos hecho la semana pasada. Realizamos una electroforesis en gel de agarosa 1.5%. El objetivo de la misma era comprobar si la PCR de la semana pasada habia salido bien.


Miestras dejabamos correr las muestras Paola, otra investigadora que trabaja en el laboratorio, nos conto un poco acerca de lo que hacia, que investigaba y nos explico sobre las lineas celulares, que tipo de crecimiento tienen, lo cual pudimos ver en el microscopio invertido ( la lente se situa por debajo de donde se apoya la muestra a examinar) .


Luego de que la corrida habia terminado, procedimos a ver con luz UV las bandas que se formaron y pudimos deducir que como dos de muestras tenian bandas más débiles debiamos usar de los mismo un poco mas de cada uno. Ahora pasamos a preparar las muestras para que sean tratadas con enzimas de restricción. Calculamos las cantidades de cada reactivo ( de producto de PCR, de H2O, de Buffer 10x y de encimas ECO 130I ). En esta parte tuvimos que hacer una pequeña modificación por el detalle que les contamos antes, con lo cual al momento de calcular la cantidad de producto de PCR que habia que utilizar para la digestión con ennzimas, tuvimos que agregar 5 ml más esas, con lo cual el volumen de agua a agregar para llevar a volumen final era distinto. A causa de esto, al momento de preparar la Master Mix tomamos el volumen menor de agua, y luego agregariamos la diferencia.


Como la incubación es overnight, lo que significa que se deja toda la noche con las enzimas, Javier dejó las muestras a 37 ºC para que se realice la digestión y luego se congelarian para que la semana que viene pudiesemos seguir trabajando con las mismas.

19 de Junio - 6ta semana de pasantia

Hicimos otra PCR con las 4 muestras de ADN, pero primero calculamos los volumenes de cada compuesto que íbamos a utilizar. La diferencia con la anterior es que esta nos iba a servir para mas adelante para hacer una electroforesis en poliacrilamida con enzimas de restricción. Previamnete se debe hacer una eletroforesis con gel de agarosa para comprobar que la PCR salio bien. Recién ahí se mezclan las muestras con las enzimas de restricción y se las deja 37 horas toda la noche.
Mientras dejamos las muestras en la cicladora( que tardaba al rededor de 3horas), preparamos una solución. Luego nos explico un sobre las células y cromosomas, también hablamos de los genes dominantes y posesivos. Otro tema fue el de los cortes homocigota y heterocigota. Esto fue para que mas adelante pudieramos saber interpretar con mas claridad los resultados obtenidos en cada una de las pruebas.
Muchas gracias por leer!

12 de Junio de 2008 - Quinta semana de pasantía

Esta semana seguimos lo que habíamos hecho en la anterior. Ahora era tiempo de comprobar si la PCR había salido bien como lo planeamos, para lo cual realizamos una electroforesis. Preparamos el gel de agarosa 1.5% (con 0,75g de agarosa y 50 ml de EDTA), y le incorporamos el bromuro de etilio (tuvimos especialmente precaución con el BrEt ya que es cancerigeno) lo pusimos en la cuba , marcamos las calles y lo dejamos secar.
Mientras tanto, a las muestras que obtuvimos de la PCR (que fueron congeladas desde la semana anterior) le agregamos el buffer de siembra con un colorante naranja (3 µ). Una vez más, con todo listo y el gel ya gelificado, sembramos las muestras, un blanco y el marcador de 50pb obteniendo mejores resultados, a diferencia de la primera vez, a la hora de sembrar y corrimos el gel a 100 ev.

Como la electroforesis iba a tardar un buen tiempo, decidimos bajar a las computadoras del segundo piso y navegar por Internet, donde nuestro investigador nos recomendó algunas páginas a partir de las cuales íbamos a poder comenzar a preparar la introducción acerca del proyecto.

Cuando volvimos al tercer piso, las muestras ya habían corrido perfectamente, con lo cual desconectamos la cuba y con precaución nos dirigimos a la habitación de PCR, donde pudimos observar los resultados con luz ultravioleta y sacarle una foto al gel (vale tener en cuenta que se veía más nítida, pero como es una foto se ve más borrosa).

(Gracias al marcador de PM se puede definir a simple vista el peso (en pb, pares de bases) aproximado del fragmento de ADN obtenido por medio de la PCR. Al saber el tamaño que el mismo debía tener, ya que estaba como condicion en el diseño del primer, pudimos verificar a través de la electroforesis que la PCR salió como lo esperábamos)

5 de Junio de 2008 - Cuarta semana de pasantía

Luego de haber aprendido a calcular concentraciones la semana anterior, esta vez lo hicimos pero en la practica. Realizamos una PCR de las muestras para amplificar el gen GSTPi-I104V, cuya función es inactivar drogas y eliminarlas del organismo.
Primero que nada calculamos, para llevar a un volumen final de 15 microlitros, los volúmenes necesarios de buffer, de MgCl2, de dNTPs, de los Primer reverse y forward (iguales cantidades), de la enzima Taq polimerasa, de cada uno de los ADN y para llevar a volumen completamos con H2O.
Como cada muestra por separado lleva iguales compuestos e iguales cantidades de los mismos, para reducir el error, preparamos un Master Mix (se multiplican las cantidades finales por la cantidad de muestras a tratar) y a partir de este pipeteamos cantidades iguales en los eppendorf, a los cuales por ultimo le agregamos las distintas muestras de ADN. Paralelamente realizamos un control negativo, al cual en vez de ADN, se lo trata con H2Od (como el primer no se pega y no hay PCR, la electroforesis no debe mostrar resultados, si sí, significa que algo interfirió en las reacciones con lo cual los resultados pueden ser erróneos.)
Teniendo todo listo y preparado, colocamos los eppendorf en la maquina de PCR (Multigene Labnet), la programamos (especificando las temperaturas de cada paso y la cantidad de ciclos a repetirse) y esperamos a que finalice el proceso.
Como teníamos tiempo de sobra, hicimos algunas soluciones junto con Javier (pertenecientes a un protocolo para la extracción de ADN plasmídico). Así que calculamos cantidades y ¡manos a la obra!

Hasta luego, los saluda Ayelén y Solange!

29 de Mayo de 2008 - Tercera semana de pasantía

En la tercera semana realizamos una electroforesis con las muestras de ADN extraídas la semana pasada. Para ello preparamos el gel de agarosa 1%, y acondicionamos las muestras y la cuba (tuvimos la precaución de verificar que las calles donde van las muestras estén del polo negativo, ya que como el ADN tiene carga negativa, corre hacia el polo positivo). Previamente a la siembra de las muestras originales, practicamos como sembrar con buffer de siembra (compuesto por glicerina 30%, colorante azul y H2Od) para así adquirir mejor manejo de la pipeta a la hora de sembrar. Luego lo hicimos con los ADN de los distintos pacientes y a lo ultimo sembramos el marcador de peso molecular (PM 50 pb- Marker). Igualmente, como eran las primeras veces tuvimos algunos inconvenientes durante la sembrada, lo cual iremos corrigiendo y perfeccionando con el tiempo.

Ya todo preparado, conectamos la cuba y la dejamos correr a 100 ev. (Verificamos la salida de burbujas, lo que significa que pasa corriente)

Mientras que la electroforesis estaba en proceso, Javier nos dio una introducción de lo que íbamos a hacer la semana entrante. Empezamos hablando sobre la teoría de la PCR, nos explico la diferencia entre hacer un primer por computadora, usando distintas paginas, a hacerlo manualmente, donde hay que tener en cuenta distintos cuidados en la practica a la hora de diseñarlo, como por ejemplo:

1) Los primer deben estar formados en lo pasible por un 50% de bases A y T y otro 50% de C y G.
2) Para que el segundo paso de la PCR, el annealing, sea satisfactorio el primer reverse y el forward deben tener una TM (Tº optima) similar. (Ya que si difieren mucho y hay q establecer una Tº media, puede que uno de los dos no se pegue ya que la temperatura es muy alta, y el otro se pegue en algún lugar indebido, ya que la temperatura para el es muy baja.)
3) Hay que tener la precaución de que el primer forward y el reverse no se peguen entre si.
Luego de charlar un tiempo mas, finalmente bajamos a las computadoras de la universidad (vale mencionar que el investigador nos dio una cuenta para que las podamos usar cuando querramos) y navegamos por Internet donde Javier nos mostró algunas paginas y los pasos a seguir para diseñar y encontrar un primer en Internet.
Al volver al laboratorio, ya casi se hacia la hora, nos menciono que en la próxima semana haríamos una PCR, para lo cual nos planteo un problema sobre concentraciones.
Debíamos calcular, sabiendo el volumen final y las concentraciones final e iniciales, cuanto volumen de cada compuesto debíamos usar (usamos datos de una PCR), así de a poco, con la practica, nos vamos a ir familiarizando con la técnica.

En esta imagen se puede ver el resultado de la electroforesis de las muestras de ADN.

Hasta la próxima.

22 de Mayo de 2008 - Segunda semana de pasantía

En nuestro segundo día de pasantía. Nos encontramos en las mesas del bar que está al lado del laboratorio, desayunamos y esperamos a que llegue nuestro investigador. Al rato de que entramos en el LAB nos contó que íbamos a hacer una extracción de ADN. Teníamos muestras congeladas de sangre que pertenecían a cuatro pacientes diferentes. Básicamente, nos contó que había dos maneras de realizar la extracción. La primera, se realizaba utilizando un kit que contiene la mayoría de los elementos necesarios para la extracción de ADN tales como, las soluciones Buffer, los tubos y las columnas con sus correspondientes filtradores. La segunda opción es muy similar a la primera, pero manual. Una de las diferencias es que cuando tengo la muestra, es necesario lavarla, o sea sacar los glóbulos rojos que pueden interferir en las reacciones posteriores. La extracción se realiza con un solvente orgánico, inmiscible. Nosotros empleamos el primer método. Datos del Kit: QIAamp DNA Blood Midi Kit (20) Cat. Nº 51183 LOT Nº 127142648 Al finalizar la experiencia, necesitábamos comprobar si el ADN estaba en condiciones para ser utilizado más tarde, o sea si no contenía impurezas, como proteínas, ó que no esté degradado, ya que cuando se saca una célula del organismo, se descompone y en consecuencia el ADN comienza a destruirse. Para comprobar todo lo anteriormente dicho hay dos maneras: Hacer una espectroforesis, utilizando gel de azarosa. Si el ADN está degradado, deja una banda corrida naranja. Si esta en trozos pequeños, los mismos quedan en la parte de abajo, ya que corren más por ser menos densos y poder pasar más fácilmente por los poros. Mediante una espectroforesis, se puede medir la absorbancia de: Los nucleótidos que forman el ADN, a una lamda de 260 nanometros, que es cuando más absorben. Las proteínas, a una lamda de 280 nm. Se hace una relación de absorbancia, 260/280, si la absorbancia da un valor menor a 1.5 no es aceptable, o sea que la muestra de ADN no es lo suficientemente pura. Optamos por la espectroforesis. Preparamos el gel de agarosa (50ml de TAE 1X + 0.5 g del gel + 3 microlitros de bromuro de etilo) y lo colocamos en la cuba, para que seque. No tuvimos el tiempo necesario para poder finalizar la experiencia y poder ver los resultados, con lo cual Javier lo realizará en la semana, lo fotografiará y nos mostrará los resultados obtenidos. (Durante el año realizaremos en varias oportunidades el mismo experimento).

15 de Mayo de 2008 - Primer día de pasantía

Este era el momento, nos sentamos a escribir por primera vez en el blog que habíamos hecho tiempo atrás y que con muchas ansias esperábamos llenar de información. No sabíamos como iniciar la presentación, así que decidimos contarlo de esta manera. Después de tanto tiempo de espera y ambas llenas de nervios por comenzar el proyecto que nos iba a sumergir en conocimientos y experiencias inolvidables y muy útiles para nuestras futuras carreras, al fin había llegado el día. Ese día, 15 de mayo de 2008 no era uno cualquiera, sino que el primero de una nueva etapa que comenzaba y continuará en nuestras vidas. Fuimos cada una por su camino hacia un destino en común, la facultad de ciencias exactas de la ciudad de buenos aires, donde nos esperaba primero que nada una charla de seguridad e higiene, que mas tarde nos reuniría con otros compañeros, cada uno con un mismo fin pero distinto proyecto. Luego de un corto lapso, durante el cual visualizamos un video informativo, acerca de cuales podían ser los casos de emergencia, que hacer y a quien recurrir ante uno de ellos, nos reunimos con nuestro investigador. Fue en el 4to piso del pabellón 2, donde tuvimos el primer contacto con el laboratorio en el cual trabajaríamos y con los integrantes de nuestro y de otros proyectos que se estaban realizando simultáneamente. La primera parte de la reunión, fue la introducción nuestra hacia el y de el hacia nosotros, donde nos presentaron al grupo de personas que trabajan allí, les contamos acerca de que se trataba el proyecto, con que fin lo realizábamos y cuales eran las tareas que debíamos realizar a partir de nuestra participación en el mismo. Esta es una de las causas por la cual hoy les estoy contando esto: la realización de una especie de informe semanal para que ustedes puedan enterarse de lo que hacemos y aprender más acerca de la investigación. Nuestro investigador, por cierto todavía no les conté su nombre, Javier Cotignola nos entrego unos papers, para que podamos individualmente sumergirnos mas en el tema e informarnos a través de ellos. Pero por supuesto, en el tiempo restante, nos explico detalladamente de que se trataba la investigación. Lo que el hace al fin y al cabo es estudiar en pacientes con leucemia que se encuentran bajo tratamientos de quimioterapia, las reacciones de los mismo ante esta, buscar las causa de la resistencia que ejercen sus organismos a la suministración de las distintas drogas y por medio de factores como la edad, sexo, la edad de formación de los tumores etc., compararlos entre si. Esta resistencia se puede dar a causa de varias razones, dentro se las cuales esta la que analizaremos específicamente mas adelante y que trata de la presencia poliformismos en el ADN. La presencia de estas modificaciones, se pueden reconocer a través del tratamiento con enzimas de restricción. Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa contra virus degradando el ADN extraño y son utilizadas en personas ya que gracias a su función de reconocer secuencias palindromicas en el ADN y cortarlas, podemos saber si el paciente presenta poliformismos observando la actividad de estas enzimas. Esto quiere decir que si las enzimas que reconocen una secuencia determinada del ADN no lo hacen, este no es cortado, lo que nos permite concluir que hay alguna modificación. ¿Cómo se hace para saber si la enzima cumple con su función? El primer paso para llevar a cabo el tratamiento es la realización de una PCR, pero como nosotras no conocíamos su significado, Javier nos dio una pequeña explicación de cómo se realizaba, y seguido de esto pudimos ver un par de videos relacionados. Básicamente, la PCR es una técnica in Vitro usada para amplificar la región específica del ADN que me interesa y quiero estudiar. Esto se puede hacer por medio de la replicación de dicha zona a través del empleo de cebadores específicamente diseñados complementarios a la misma. Para replicar la zona, se necesita calentar a 95 °C para poder separar la doble cadena a través de la ruptura de los puentes de hidrogeno formando una simple. Como esto se realiza a tan alta temperatura la enzima encargada de polimerizar gracias a la presencia del primer diseñado que se une a la cadena de ADN cuya región queremos estudiar y le brinda un extremo 3´OH para que la enzima cumpla con su función, debe ser resiste a esa temperatura: la Taq Polimerasa es la que se utiliza en este proceso, la cual se obtiene de bacterias. Luego se reduce a 60 °C, temperatura a la cual el primer forma la unión fuente de hidrogeno con la cadena complementaria del ADN. Finalmente a 72 °C ocurre la elongación, temperatura optima a la cual funciona la taq polimerasa, adicionando nucleótidos complementarios a las bases. Cuando el ciclo termina, se obtiene 2 copias dobles cadenas de ADN, luego del segundo ciclo hay cuatro copias de la cadena de ADN pero todas ellas contiene restos de cadena de ADN, las cuales no son de nuestro interés. Luego de cuatro ciclos, la mitad de los fragmentos consisten solo en la porción de ADN de mi interés. Esta es básicamente la explicación que el investigador nos dio. Después hablamos acerca de la espectroforesis, que es la forma de darse cuenta a través de el sembrado de varias muestras de este segmento de ADN obtenido por medio de la PCR, cuales cadenas son mas densas, así podemos concluir cuales fueron cortadas por las enzimas de restricción. Las cadenas que sí sufrieron esto, es porque no tienen modificaciones a nivel ADN. Espero que se hayan entretenido y que les haya servido para aprender un poco más. Acá les dejamos algunas página que tiene mucha información y animaciones sobre replicación, transcripción, traducción y muchos más temas. Disfrútenlo! http://science.nhmccd.edu/biol/bio1int.htm#dna http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072437316/student_view0/

http://bcs.whfreeman.com/pierce1e/default.asps=23000&n=00020&i=23020.01&v=c&o=&ns=0&t=&uid=0&rau=0



Nos vemos el próximo jueves.

Curriculum Vitae de Javier Cotignola

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